EMPREGO DE CÉLULAS PROGENITORAS NO TRATAMENTO AGUDO DA LESÃO MEDULAR EM HUMANOS

RESUMO: A lesão traumática da medula espinal consiste numa das mais incapacitantes lesões que o ser humano pode sofrer e tem despertado grande interesse no conhecimento das alterações histopatológicas, bioquímicas, funcionais e principalmente na busca de métodos de prevenção e tratamento. O presente estudo tem por objetivo analisar prospectivamente o efeito de células progenitoras indiferenciadas da linhagem hematogênica no tratamento agudo da lesão medular.

UNITERMOS: lesão medular, células indiferenciadas, humanos

ABSTRACT:

The spinal cord lesion is one of the most devasting injuries that happens to men.Nowadays there isn’t any kind of efective treatment for patients with spinal lesion. The purpose of this study is to avaluate the results of the infusion of stem cells in patients who suffer a spinal lesion.

KEYWORDS: spinal cord injury, stem cellsfetal cells, men.

EMPREGO DE CÉLULAS PROGENITORAS NO TRATAMENTO AGUDO DA LESÃO MEDULAR EM HUMANOS

INTRODUÇÃO

O traumatismo raquimedular era tido com uma doença sem tratamento. Até dez anos atrás, tudo o que poderia ser feito era estabilizar a coluna, tratar infecções e espasticidade e prescrever fisioterapia.¹³^,16. Contudo, o desenvolvimento de pesquisas nesta área indica que as lesões agudas na medula espinal podem ser minimizadas com o uso de drogas, desde que administradas num curto espaço de tempo após o trauma ^{11,25,
28, 62, 68}.

No início deste século foram realizados os primeiros experimentos acerca da fisiopatologia da lesão espinal ²^,
3. Contudo, estes trabalhos só foram retomados na década passada por investigadores que começaram a valorizar as mudanças tempo dependentes na patologia do trauma raquimedular^{4, 7,}.

O imenso déficit neurológico decorrente da lesão da medula espinal advém da somatória de dois eventos distintos: a lesão mecânica inicial e a lesão endógena secundária conseqüente à primeira ⁷^{,
8, 23, 24, 33, 46, 60, 64}. A lesão primária é produzida pelo trauma em si, com morte celular e liberação de eletrólitos, metabólitos e enzimas, sendo, portanto um processo mecânico que independe de controle celular. A lesão secundária da medula espinal envolve complexas mudanças bioquímicas, surgindo como cascata de eventos envolvendo edema, inflamação, isquemia, reperfusão, fatores de crescimento, metabolismo do cálcio e peroxidase lipídica onde os esforços científicos se concentram para possibilitar seu controle ⁸^{,
9, 26, 27, 35, 43, 44, 45, 52, 58, 59, 63, 64}. Farmacologicamente, drogas moduladoras das respostas endógenas à lesão primária estão sendo progressivamente introduzidas a fim de limitar o dano tecidual e melhorar o potencial de recuperação funcional destes pacientes. Estas drogas visam interromper os mecanismos fisiopatológicos de lesão neuronal secundária^{29, 30, 49, 67}.

Avanços clínicos e científicos indicam que as lesões agudas na medula espinal podem ser manipuladas por terapêuticas farmacológicas utilizadas num curto espaço de tempo. A metilprednisolona administrada dentro das primeiras 8 horas pós-trauma é o primeiro agente farmacológico a demonstrar melhora significativa na recuperação do trauma raquimedular em seres humanos ⁵^{,
12, 13, 14,15, 22, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 51, 57,}. Outras drogas, como tirilizade ⁶^{,
40, 42} e o GM-1 ^{20, 31, 32, 34, 47, 48, 65, 66}, ainda sob investigação clínica, apresentam promissores resultados preliminares. Estes avanços podem representar grande melhora na qualidade de vida de pacientes com lesão da medula espinal, desde que sejam adotados pela prática clínica. Após lesões do sistema nervoso central há um período de déficit seguido de período de variável recuperação funcional. Tal recuperação se deve principalmente a alterações nos circuitos não lesados, mas o processo exato de recuperação ainda não foi completamente esclarecido.

O tratamento ideal para a lesão medular seria aquele que não apenas diminuísse a lesão, mas que também estimulasse o processo de reparação. Ao contrário do conceito de dez anos atrás, já esta provado que neurônios fora do sistema nervoso central, na medula espinal imatura e em meios especiais de cultura podem regenerar.⁵⁰

Atualmente têm sido desenvolvidas linhas de pesquisas para utilização de neurotransmissores, transplante de células fetais, transplante de células indiferenciadas, implante de eletrodos, emprego de substâncias promotoras de remielinização; mas ainda não apresentam resultados definitivos.⁵⁰

A utilização de transplante de células indiferenciadas e células precursoras em estudos para tratamento da lesão medular tem cerca de dez anos. Células indiferenciadas são células multipotentes que apresentam a capacidade de se proliferar e originar células de qualquer linhagem e de qualquer tecido. Em animais foi provado que células indiferenciadas transplantadas na medula normal ou lesada pode se diferenciar em neurônios ou em glia.⁵⁰ Células precursoras de neurônios podem ser isoladas e expandidas em culturas na presença de mitógenos, e quando transplantadas podem originar neurônios e oligodendrócitos. Podem ainda se diferenciar em astrócitos, evidenciando que sinais do ambiente são determinantes na especificação da linhagem.^1,18

Outro conceito foi recentemente alterado quando se provou que células adultas podem ser reprogramadas a expressar genes típicos de células diferenciadas de qualquer uma das três linhagens: mesoderma, ectoderma e endoderma. Este fato possibilitou a constatação de que o estado diferenciado das células é reversível e que requer regulação contínua do meio, possibilitando estudos como o que provou que após irradiação letal, células derivadas da medula óssea administradas endovenosamente originaram células que expressavam genes específicos de neurônios.¹⁶

Pelo menos duas populações de células progenitoras têm sido identificadas na medula óssea: as células progenitoras hematopoéticas (CPH) e as células progenitoras mesenquimais (CPM).

A CPH é facilmente identificada através da expressão do antígeno CD 34. O antígeno CD 34 é uma glicoproteina transmembrana que está expresso em todas as CPH assim como na célula endotelial, no fibroblasto embriônico e em algumas células do tecido nervoso fetal e adulto. As células que expressam o antígeno CD34 são denominadas CD 34 positivas (CD34+) e são identificadas por citometria de fluxo, utilizando-se o anticorpo monoclonal - anti CD 34. As CPH têm alta expressão do antígeno CD 34 na sua superfície celular.

Por outro lado, ainda não conhecemos nenhum marcador de superfície celular que possa caracterizar as CPM. Até o presente momento, esta células são identificadas apenas através de cultura celular. Algumas evidencias atuais sugerem que as CPM apresentam baixa expressão de CD 34.

Estas duas populações celulares – as CPH e as COM - estão presentes na medula óssea e, e em condições normais, apenas 0,1% delas circulam no sangue periférico. Este número pode ser aumentado em aproximadamente 30-50 vezes após a administração de fatores estimuladores de colônias hematopoéticas, especialmente o G-CSF (Granulocyte – Colony Stimulating Factor). Por esta razão o G-CSF tem sido considerado como um fator mobilizador da células progenitoras da medula óssea para o sangue periférico.

OBJETIVO

O objetivo do presente trabalho é avaliar o efeito da infusão de células progenitoras indiferenciadas autógenas no tratamento agudo de pacientes com lesão medular.

MATERIAL E MÉTODOS

Serão selecionados 30 paciente dentre os pacientes com diagnóstico de trauma raquimedular agudo que são rotineiramente acompanhados no Grupo de Coluna Cervical e Trauma Raquimedular do Instituto de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Estes pacientes serão protocolados e submetidos a exame inicial de acordo com a tabela da ASIA e serão tratados de acordo com os protocolos aceitos internacionalmente. Os procedimentos cirúrgicos, quando pertinentes, serão realizados no período máximo de 48 horas após o trauma raquimedular. No segundo dia do período pós-operatório, estes pacientes serão submetidos a exame de sangue para avaliação hematológica e de distúrbios de coagulação.

Os pacientes que não apresentarem distúrbios de coagulograma e hemograma, serão encaminhados ao Hemocentro do Hospital Das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo onde será realizadaa mobilização e coleta das células progenitoras em sangue periférico. Estas amostras serão analisadas e criopreservadas. Ainda durante a fase aguda do processo ( até 15 dias após o trauma raquimedular) o concentrado de células progenitoras será reinfundido através de acesso venoso periférico no paciente doador caracterizando o momento zero do experimento.

Este paciente será então avaliado quinzenalmente nos primeiros três meses, mensalmente até o término do primeiro ano e trimestralmente até o término do quinto ano de experimento no ambulatório de Coluna Cervical e Traumatismo Raquimedular, onde será submetido a exame clínico de acordo com a padronização preconizada pela ASIA para avaliar-se a recuperação neurológica após a infusão de células indiferenciadas.

Seleção de Pacientes:

Serão incluídos no estudo pacientes acompanhados no Grupo de Coluna Cervical e Trauma Raquimedular, maiores de 18 anos, em fase aguda de trauma raquimedular, com exames laboratoriais de hemograma e coagulograma dentre dos valores considerados normais após o tratamento inicial preconizado a seus casos e que voluntariamente aceitarem participar do experimento.

Mobilização das células progenitoras:

A mobilização das células progenitoras da medula óssea para o sangue periférico será feita através da administração sub-cutânea de G-CSF na dose de 10 mg/kg/dia, por 05 dias consecutivos.

Coleta das células células progenitoras:

Uma vez mobilizada, as células progenitoras presentes no sangue periférico serão coletadas por aférese. A coleta será realizada utilizando-se separador celular de fluxo contínuo. Em cada coleta será processado um volume sanguíneo equivalente a 02 volemias do paciente.

Será realizada uma coleta por dia, em dias consecutivos. Realizaremos o número de coletas necessário para a obtenção de no mínimo 2,5 x 10⁶ células CD 34+/ kg de peso do paciente.

A análise das células CD 34 positivas será realizada por citometria de fluxo.

O número mínimo de células CD34+ necessários para o tratamento da lesão medular crônica não está definido na literatura atual. Estabelecemos o número mínimo de 2,5 x 10⁶ células CD 34+/ kg de peso/paciente, número suficiente para reconstituição hematopoética a curto e a longo prazo em pacientes que receberam terapia mieloablativa para o transplante de medula óssea. Entendemos que se este número é suficiente para reconstituição de toda hematopoese também deve ser suficiente para reconstituição do tecido nervoso lesado.

Criopreservação celular

Após a coleta, as células progenitoras serão criopreservadas utilizando Dimetil Sulfóxido como agente crioprotetor, a uma concentração final de 10%. O congelamento será programado de forma a produzir redução da temperatura das células em 1ºC/ min até 40º C negativos, e a partir de então, a redução de 10º C/min até 80º C negativos. Neste momento as células serão transferidas para um freezer mecânico de temperatura igual ou inferior a 120º C negativos.

Expansão celular

Este concentrado de células indiferenciadas serão expandidos em meio de cultura propício ao desenvolvimento de células de linhadem neuronal e será reinfundido no paciente doador.

Infusão das células

Imediatamente antes da infusão, as células serão descongeladas em banho-maria a 37º C. Quando estiverem totalmente descongeladas serão infundidas na circulação periférica do paciente, a uma velocidade de 10 ml/min, utilizando-se equipo comum de transfusão (170m).

Seguimento Clínico.

O paciente será então seguido no ambulatório de Coluna Cervical e Trauma Raquimedular do IOT-HC-FMUSP onde será submetido a exame clínico preconizado pela ASIA.